《本草纲目》的编写所参考书籍甚多。据有人统计他所引据的典籍758种，精读的“子史经传声韵农圃，医卜星相，乐府诸家”近800多种，时珍先后读过《素问》、《灵枢》、《难经》、《甲乙经》、《东垣试效方》等古代医书277家;本草学名著84家，引据《说文解字》(许慎)，《字说》(王安石)，《名苑》(司马光)等古今经史440家;转引《易经注疏》等共151家。正如《本草纲目》自序中所载：“渔猎群书，搜罗百氏”。
李时珍为明确药物产地、形态等，他不畏艰苦亲自到各地采访，搜集各种物标本。从公元1552年开始编写，时年35岁，并动员全家人，包括四个儿子，四个孙子，以及他的学生弟子，都参与编写与校订。经过27年的努力，于1578年完成这一部190多万字的巨著初稿，后又经过十年做了三次修改和重编，前后总计40多年，于公元1596年(明万历二十四年)时珍过世后三年出版。
《本草纲目》是以唐慎微的《证类本草》为蓝本，并吸收了《神农本草经》、《名医别录》、《唐本草》等有关著作的成就，结合自己的经验进行加工、整理而成的一部药物学巨著。书中对每种药物的产地、性味、形态、采集方法、炮制过程、药理研究、方剂配合都详加叙述。特别是在药物分类方面，采用析族、区类、振纲、分目的方法，从无机到有机，从低等到高等，顺序是：水、火、土、金石、草、谷、菜、果、木、服器、虫、鳞、介、禽、兽、人部等16部，每部又分若干类，共62类。这种以纲挚目，纲举目张的分类方法，在当时世界上是最进步的。书中的植物分类法，对植物学的研究工作有很大贡献，比西方植物分类学创造人瑞典的博物学家林奈的《自然系统》(1735)提出的植物分类法早157年。
《本草纲目》书中已有进化论思想，它关于动物的分类，是按照由低级到高级的进化顺序排列的。李时珍已认识到生物对环境的适应性，提出某些动物“毛协四时，色合五方”。同时，已知利用生物适应环境的特性，进行人工饲养和改良品种。李时珍又观察到动物的相关变异和突然变异现象，如乌骨鸡的骨、舌皆黑，饲养金鱼的颜色可以突然变化等。达尔文在其著作中曾引用《本草纲目》的资料。
《本草纲目》共52卷，载药1892种，其中374种为新增药物，有植物1094种，动物性药物443种，矿物性药物355种。附方11096首，插图1160幅。书中还十分重视药理的研究。对一些药物的确实疗效重新作出结论，如指出土茯芩治梅毒，延胡索可止痛，常山有截疟作用，使君子，鹤虱，雷丸有杀虫作用等。同时书中还批判了一些不合理的传说，如以往记载服食水银、雄黄可以成仙，服食“金丹”可以长生不老，李氏不仅从理论上加以否定，而且指出服食的危害性。又如对“草子变鱼”，“马精入地变为锁阳”等说法，经过实际观察，都加以改正，指出鱼是鱼子所化，锁阳是一种植物。
李时珍在书中纠正了前人本草书中的某些错误。如把一药误认二物的南星，虎掌作了更正;把误为兰草的，正为兰花;把误为百合的正为卷丹;天花粉、括萎本是一种植物的块根和果实，过去却绘成两种不同的植物，对此进行了纠正;把误列为草类的生姜、薯蓣，重新分入菜类。《本草纲目》还对无机药物的化学性质以及蒸馏、升发、沉淀、烧灼等技术作了阐述。
《本草纲目》书成后不久，于1590年由金陵胡承龙刻印，由王世贞作序，在1596年正式出版而刊行。这是本书的最早刻本。现在上海图书馆藏有此书，其后此书屡行再版。如公元1603年《本草纲目》又在江西由夏良心、张鼎思重刻。1655年(清顺治十二年)钱塘的吴毓昌重新复印。《本草纲目》至今在国内有30多种刻本。
《本草纲目》不仅在国内有深远的影响，而且在国际上也有较大的影响。公元1606年时，《本草纲目》即由日本学者林道春首先传入日本，1637年日本的翻印本出版。1783年又有由日本小野兰山译为《本草纲目译说》附注解的日译本出版。1929年日本人白井光太朗按照金陵版，翻译为《国译本草纲目》十五册。本书的问世引起了日本医药界的震动，对于日本植物学和药物学的研究，产生了巨大的影响。在日本有关研究'本草纲目'的书就有九种之多，并且编写了许多配图本和袖珍本。一直到今天在日本对于《本草纲目》仍视为珍宝。1647年波兰人卜弥格将《本草纲目》译为《中国植物志》于1657年以拉丁文出版。1735年在法国巴黎出版的《中国史地年事政治纪录》中有法文的《本草纲目》数卷，在英国也有两种《本草纲目》英语全译本流行。据不完全统计，《本草纲目》在世界上有拉丁文、法文、德文、英文、日文、俄文、西班牙文、朝鲜文等八种文字的译本流传。被誉之为'东方医学巨典'。英国著名生物学家、进化论的创始人达尔文在《人类的由来》一书中，还径直把它称为“中国古代的百科全书”。
《本草纲目》是一部划时代的科学巨著，是我国十六世纪以前本草学的全面总结，它集中反映了我国医药学家和劳动人民的卓越智慧，是我国科技史上极其辉煌的硕果，是医学宝库中一份极其珍贵的遗产。